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[试剂耗材] 高特异性低毒性SiR-DNA染色试剂盒

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发表于 2019-4-30 16:42:26 | 显示全部楼层 |阅读模式
目前市面上有几种DNA荧光探针,如溴化乙锭(EB)、DAPI、Hoechst™和远红色染料,如SiR-DNA™(SiR-Hoechst*)、Syto61™、Draq5™或Vybrant®Dyecycle™Ruby。目前,在活细胞的DNA染色中,有两组染料。第一组是Hoechst系列,它们具有细胞渗透性和荧光性(即低荧光直到结合靶DNA),但由于340-360nm范围内短紫外-蓝色波长激发的要求,它们具有相当的毒性。
第二组活细胞染料由远红外染料组成,如SiR-DNA™、Syto61™、Draq5™或Vybrant®Dyecycle™Ruby。这些染料克服了前一组光谱范围的限制,允许使用波长约为650nm、发射波长约为700nm的低能激发光。这种光具有最小的光毒性(SiR-Tubulin™和SiR-Actin™)并且细胞或组织样品在该光谱范围内不吸收光也不自发荧光,这使得在厚样本中有更深处成像成为可能。
相比之下,DAPI和溴化乙锭不具有细胞渗透性,DAPI需要短的紫外波长激发,EB是蓝光波长,在350 nm范围内非常有很好的活力,这两种染料活细胞成像超过1-10分钟,会对活细胞造成光损伤(氧化)。
此外,在这个光谱范围内,组织和细胞具有很高的吸收率和自发荧光。因此,很难在组织样本的深处成像。最后,由于细胞暴露在激发光下的时间有限,这些染料不适合超分辨率分析,且溴化乙锭会导致细胞发生突变。
SiR-DNA™(SiR–Hoechst)是基于荧光团硅罗丹明(SiR)和DNA小槽粘合剂双苯甲酰亚胺(Hoechst)组合而成,它比远红外染料组其他染料更具优势。
Syto61™、Draq5™或Vybrant®Dyecycle™红宝石染料的问题在于:它们要么在厂家建议使用的浓度下对细胞显示出强烈的毒性作用(细胞停止分裂或死亡),而SiR-DNA可以在8小时的正常实验时间内持续使用,而且可能更长。Syto61™、Draq5™或Vybrant®Dyecycle™等红宝石染料也在活细胞的DNA以外的其他结构上产生强烈的非特异性信号。
SYTO61与超分辨显微镜兼容,但其高背景荧光和毒性使其不具有吸引力,SiR-DNA信号在多次暴露于激发光下时仍然很强,在稳定性测试中,在140次暴露/时间点记录后,染料保持了其原始强度的70%。

                               
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SiR–Hoechst(SiR-DNA™)和其他远红外DNA染料长时间活细胞成像对比图,显示SiR–Hoechst的低毒性及荧光稳定性
市面上几种常见DNA染料对

                               
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注:SiR-DNA™是Spirochrome SA公司的商标(瑞士)
Vybrant® DyeCycle™ Ruby stain 和Syto61™是美国Thermo Fisher Scientific公司的商标
DRAQ5™是Biostatus公司商标
Hoechst™是美国Sanofi公司商标
SiR-DNA™的主要发展方向是将荧光特性、高DNA特异性、低毒性与远红外激发/发射范围相结合。此外,由于其稳定性和对远红光的特性,探针在超分辨显微镜(STDE和SIM)中表现非常好。因此,SiR-DNA™是一种优良的探针,其性能与SiR-tubulin和SiR-actin一样优秀。
在显微镜观察和高通量筛选过程中,SiR-DNA™可以在不受紫外线刺激的情况下进行简单的核复染。在流式细胞术过程中,SiR-DNA™可以直接用于血液/BM的表型分析和细胞DNA含量分析,而无需红细胞溶解或固定、渗透或RNase处理等步骤。
这里艾美捷比较推荐全球畅销的活细胞DNA染色试剂盒: SiR-DNA染色试剂盒  CY-SC007; 试剂盒均内含Verapamil(维拉帕米,戊脉安),一种广谱的外排泵抑制剂。
厂家质检:

                               
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常见问题整理:
是否兼容固定细胞?
SiR-DNA™可以与甲醇或PFA固定的细胞一起使用。然而,介质对SiR-DNA™的亮度有很大的影响。当混有PBS或Vectashield®的细胞产生很低的信号,混合有纯甘油的细胞会染出非常明亮的细胞核。因此,我们建议在用SiR-DNA™染色固定细胞时使用纯甘油作为介质。
哪些物种的样本和组织能被SiR探针染色?
下方仅引述已报告起作用的细胞系、组织或生物体。
智人:U2OS,成纤维细胞,HeLa,HUVEC, MCF-10A, HCT-116, A549,红细胞
肌肉:C2C12,IA32,骨骼肌,原代心肌细胞,原代卵母细胞
褐家鼠:初级海马神经元、初级皮质神经元、NRK
风信子:COS-7
金鲫:BHK
黑腹果蝇:Notum上皮,S2
迪德尔菲斯有袋动物:OK细胞
为什么SiR探针的背景比其他荧光团低?
SiR探针使用的是近红外/远红外光谱范围内的激发光,从而避免较短波长的光产生自发荧光,从而避免产生较高的背景。SiR耦合探针具有两种物理状态:①非荧光,关闭状态(spirolactone)和②高荧光,开启状态(zwitterion)。探针与其配体目标的结合有利于高荧光的开放状态,而未结合探针则存在于封闭、非荧光状态(下图)。从未结合态到结合态荧光放大率增加100倍。这就产生了一种高度敏感的生物传感器,其中大部分荧光只发生在结合态。

                               
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SiR衍生物在荧光(开放)型(左结构)和非荧光(封闭)型(右结构)之间存在平衡
NatureCommunication专属产品文章精彩了解:
G. Lukinavicius et al.,SiR–Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy, Nat. Commun. 6:8497 doi: 10.1038/ncomms9497 (2015).

                               
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