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实验室检测指导的恶性血液病个性化治疗

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发表于 2014-2-12 10:13:26 | 显示全部楼层 |阅读模式
由于生物多样性的特点,研究疾病新的治疗方法时,一般采用随机分组对照或配对随机分组的研究,以消除患者多种差异的影响,从而比较出更有效的治疗方法,为临床医生为患者选择治疗提供了有力的证据,所以国际好的杂志愿意选择刊登大病例随机分组临床研究的结果,临床医生根据这些结果做出的治疗选择也是最不容易被同行诟病的。    但是,每个患者都具有生物学和社会学的独特性,导致同一疾病患者对治疗反应有很大差异,很多因素可影响疗效,如年龄、种族、经济条件、个人性格,累及细胞的基因、染色体、免疫分型,药物代谢基因等。以骨髓增生异常综合征或白血病前期为例,迄今报道了600多种异常。这些因素组合起来,导致每个患者是如此的不同,面对每个患者我们都会发现有很多未知的东西。我们曾经遇到这样一对病例:一对同卵双胞胎,均患TEL-AML1基因异常急性B淋巴细胞白血病,他们的生长环境相同,并在在同一组医生那里得到完全相同的治疗,但结果却大不一样,一个治愈了,另一个却复发了。曾经有一个医生开始采用一种试验药物治疗一个晚期肺癌患者,获得惊人的好效果。但是在随后的大病例数随机分组临床试验中,该药物并未提高患者的生存率,因此美国药品食品管理局未批准该药物进入临床。此后进一步研究显示,该药物仅对VEGF阳性的肺癌有效,而VEGF阳性的肺癌仅占肺癌的10%。因此大病例数的随机分组临床研究结果并不一定都正确。最近国际人类基因组研究结果显示,每个人是不同的,每个患者也是不同的。
    在临床实践中,如果完全根据循症医学临床研究结果制定治疗计划,对患者进行千篇一律的治疗,很难达到整体最好的治疗效果。以预后良好性急性白血病为例,即使按国际最好的方案治疗,治愈率也只有50-60%。30多年前,急性早幼粒细胞白血病(APL)的死亡率几乎100%,最近我们团队在蒽环(醌)类药物联合口服四硫化四砷及全反式维甲酸治疗的基础上,同时还注意个性化用药,连续治疗40多例患者,100%获得长期完全分子生物学缓解。这说明,恶性血液病治疗疗效还有很大的提升空间,个性化治疗可能是提升疗效的重要方法。
    如何指导个性化治疗呢?以恶性血液病为例,我们知道,治疗方案应该随着患者的年龄、脏器功能、性格、经济状况等有所调整。除了这些常见的因素外,随着多种检验技术的发展,对人类生物学特性及疾病发生发展机制更加深入的了解,以及越来越多的靶向药物进入临床, 用实验室检测指标指导的个性化治疗越来越成为现实。以下提出几种我们常用的或准备采用的方法,希望起到抛砖引玉的作用。
1        正确全面的诊断
    随着免疫学、细胞遗传学及分子遗传学、分子生物学的发展,对疾病发病原因更深入的了解,发现综合多种方法对恶性血液病进行诊断和分型重复性更好、更客观,且更能反映疾病亚型的生物学及临床特征,能更好地帮助判断预后,指导制定治疗方案及策略,监测疗效。从1995年开始,世界卫生组织(WHO)成立了一个指导委员会,提出恶性血液及淋巴系统疾病的统一诊断与分型标准,分别于2001年、2004年、2008年修订。恶性血液病的诊断与分型进入了整合诊断与分型的时代。
     WHO提出,在患者初次就诊时,只要条件许可,尽可能给患者进行全面的检查评估,除了全面病史、体格检查、生化、三大常规、按病情所需进行的其它检查外,特别要进行形态学、免疫学、细胞遗传学与分子遗传学、分子生物学,甚至病原学的检测。
     我们在临床经常遇到由于未作全面分析或检测技术错误导致误诊的病例:如把遗传免疫缺陷、病毒感染诊断为淋巴瘤,或反之,把急性粒单核细胞白血病诊断为慢性粒单核细胞白血病,或反之;把FIP1L1-PDGFRa阳性的恶性血液病诊断为慢性髓性白血病,把淋巴瘤诊断为急性白血病,或反之;把急性单核细胞白血病或急性粒细胞白血病诊断为急性早幼粒细胞白血病,或反之等等。
2        药物代谢基因、药物浓度与药物剂量
    一些治疗血液病的关键药物的代谢基因明显影响药物浓度,从而影响疗效或引起严重毒副作用。我们曾经遇到过这样的患者,用常规的伏立康唑剂量治疗肺部霉菌感染2天就发生心脏骤停或严重精神神经异常;一个患者仅用半量伏立康唑就引起严重肝功损害,将药物剂量减为常规量的1/4治疗2周后,同时加用保肝药,肝功改善,肺部感染消失。这些患者有药物弱代谢性基因,因此药物浓度会超过治疗水平。由于这些副作用为致命性,检测药物代谢基因可以预测药物的副作用。因此在临床实践中,如果必须使用此类药物,我先用半量药物,同时检测此类药物代谢基因CYP2C19*2,如果为弱代谢性,继续使用半量,如果还有毒副作用,就用常规的1/4量;如果为正常代谢性基因,就用常规剂量。
    一些治疗浓度和毒性浓度差异很小,有患者仅用1克的氨甲蝶呤(MTX)就产生严重肾功衰竭,用3克MTX就发生白质脑病等,这些情况可以在用药后监测血液药物浓度调整药物剂量,从而维持药物浓度在安全有效水平,或指导解救药物使用时间和剂量。
     研究发现,很多药物的毒性或疗效与药物代谢基因有关,可以通过检测药物代谢基因或监测药物浓度来调节剂量。
    糖皮质激素毒性与谷胱甘肽-S-转移酶 (GST)-M1有关, GST-M1裸基因者用糖皮质激素后易发生严重感染;GSTM1非裸基因型患者的复发率高;如果同时有胸苷酸合成酶(TYMS)3/3基因型,其复发率更高。急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞抗凋亡基因MCL1高表达与强的松(Pred)治疗抵抗有关,前凋亡基因KRK高表达的细胞对左旋门冬酰胺酶(L-ASP)敏感性高,但前凋亡基因BCL2L13高表达者则对L-ASP治疗抵抗。
硫代嘌呤甲基转移酶(TPMT)可以灭活硫代嘌呤,所以TPMT活性的多态性影响这类药物对ALL的疗效。约10%的患者有该酶的杂合子缺陷,0.03%有纯合子的缺陷,当这种酶缺陷的患者接受硫代嘌呤治疗时,容易发生严重血液学毒性,而且容易发生治疗相关的AML或放疗相关的颅内肿瘤;反之,当患者该酶的活性太高时,用硫代嘌呤这类药物治疗药物浓度往往不够,恶性容易复发。
     Sorich 等(2008) 发现,有48种基因与氨甲碟啉(MTX)治疗后恶性细胞的减少程度及长期无病生存率(DFS)有关。前凋亡蛋白半胱天冬酶8相关蛋白2(CASP8AP2)水平低与治疗后高微小残留白血病(MRD)、低无病生存率有关,反之预后好。有亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR) 1298 AC变异体及有蛋氨酸合成酶还原酶(MTRR)66G位点者,细胞对MTX的敏感性低;MTHFR A1298C基因多态性与MTX治疗的毒性有关。
      Lugthart 等(2005)研究了441例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者,发现有45种基因与恶性细胞对强的松(pred)、长春新碱(VCR)、左旋门冬酰氨酶(L-ASP)、柔红霉素(DNR)交叉耐药有关;根据这些基因的表达,可以将患者分成疗效好和不好两组。拓扑异构酶II α(TOP2A)基因低表达的细胞对DNR抵抗。表达以下基因者化疗后微小残留白血病(MRD)高,包括参与有丝分裂的基因 BUB3、MAD2L1、NUSAP1,参与细胞周期进展的基因CCNB2 、CDC2、CKS1B。骨髓间充质细胞门冬酰氨合成酶基因(ASNS)表达低者对L-ASP的疗效好,而ASNS表达高者对L-ASP 容易耐药。
     格列卫治疗多种络氨酸激酶活性高的血液肿瘤,如慢性髓性白血病等疗效好,但是有ATP结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)等基因者,CML细胞表达WT1高者用格列卫(IMT)治疗疗效差。
药物的疗效与药物浓度有关,以上影响药物代谢的酶也是通过影响药物浓度来影响药物疗效的,因此检测药物浓度可以预测药物的疗效。
2 基于恶性血液病危险分层的治疗
   任何疾病在不同患者预后都不完全相同。临床及实验研究者都致力于研究一些预后因素,将患者分为预后良好、中等、预后差几大类,从而对患者采用不同策略或路径的治疗。由于恶性血液病很多,以下举例说明按危险程度分层治疗的意义。
2.1. 急性白血病的危险分层
    高危险性急性白血病如果仅用化疗,长期无复发生存率一般<10%,而低危险性急性白血病用化疗的治愈率一般>50%, 中等危险性用化疗的治愈率在两者之间。因此对于高危险性急性白血病,如果条件许可,尽量在化疗获得完全缓解或部分缓解就尽早行异基因造血干细胞移植,对那些化疗难以获益的急性白血病(如MDS继发的急性白血病),可不化疗直接移植。对于低危险性患者,一般首选化疗,化疗效果不好再移植。而对于中危险性患者,化疗获得完全缓解后,如果有同胞HLA完全相合的供者,可首选移植,否则首选化疗,无效后再移植。
2.1.1. 高危险性急性白血病
n      急性髓性白血病(AML):染色体单体异常, Inv(3)/t(3;3),≥3个的复杂染色体异常,-5、5q-、-7、 7q-、T(9;22)(BCR-ABL)、-17、伴其它改变的17p异常、除t(9;11)MLL-AF9以外的累及11q23/MLL基因的异常、 t(1;22)(p13;q13) /RBM15-MKL1、 t(6;9)(p23;q34)/DEK-NUP214、染色体正常但FLT3阳性、血WBC>100´109/L
n      急性淋巴细胞性白血病(ALL): T(9;22)(BCR-ABL)、t(4;11)(MLL-AF4)、t(1;19)(E2A-PBX1)、-7、+8、累及11q23/MLL、亚二倍体、复杂染色体异常、血WBC>100 ´109/L
n       混合性白血病
2.1.2. 低危险急性白血病:
l        AML:无c-KIT基因突变、无-Y染色体的 t(8;21)(q22;q22)/ AML1-RUNX1(AML1-ETO)或 inv(16)(p13q22)/ t(16;16)(p13;q22)/CBFβ-MYH11 AML,单纯NPM1基因突变
l        B-ALL: WBC<50´109/L、T(12;21)/TEL-AML1、12p异常、超二倍体
2.1.3. 中等危险:间于以上两类之间
2.2. 慢性B淋巴细胞白血病(B-CLL)的危险分层
     B-CLL是一组生存期差异很大的疾病,有些患者不治疗可生存20多年,而有些患者,如伴随血小板降低或贫血的患者中位生存期则仅19-69月。以下这些因素与患者的生存期有关:淋巴细胞倍增时间(LDT)、淋巴细胞绝对值、β2微球蛋白(B2M)、IgH高突变率、ZAP70表达、CD38表达、del(11q22)(11q-)、del(17p13)(17p-)、TP53基因突变或缺陷。因此我们要检测这些指标,对于药物治疗疗效差、生存期短、条件允许的患者,应及时做异基因造血干细胞移植。
      美国MD Anderson 癌症中心及Mayo Clinic观察了³25%核型del(17p13)、 ≥ Rai I期、IgHV无高突变三个预后因素对患者存活期的影响,发现如果没有一个不良因素,3年生存率分别为100%、95%;如果有1个不良因素,3年生存率分别为54%、95%;如果有2个不良因素,3年生存率分别为0%、72%;如果有3个不良因素,3 3年生存率为0%、22%。
     目前,福达拉滨联合环磷酰胺及CD20单抗(RTX),也即FCR方案是治疗B-CLL的一线治疗方案。但是有del(17p13)或 TP53缺陷者对嘌呤核苷类似物(福达拉宾、pentostatin, cladribine), 烷化剂 (瘤可宁、环磷酰胺、bendamustine), 或联合CD20单抗美罗华(RTX疗)效差,对FCR疗效差;但对大剂量甲基强地松龙、CD52单抗或异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)疗效好;最近报告联合CD52单抗及大剂量激素治疗未治疗过的17q-患者,完全缓解率(CR)率达65%,但治疗曾经治疗过的患者CR率仅14%。但由于17p-用药物治疗生存率低,仍建议用CD52单抗及大剂量激素治疗减低肿瘤负荷后行异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)治疗。
3 基于靶向指标及监测的治疗
     靶向就是主要针对某些细胞上某一特定的靶点进行攻击,由于具有特异性,对其它细胞影响小的优点,近年来成为肿瘤治疗的最大热点。随着对恶性血液病细胞免疫学、细胞与分子遗传学、分子生物学、蛋白功能等研究的深入,发现恶性血液病细胞上越来越多的成分与正常细胞不同,可以成为靶向治疗的靶点:恶性血液病细胞融合基因可以成为反意寡合苷酸基因治疗的靶点,细胞异常基因的蛋白产物可以成为药物、免疫细胞、或单克隆抗体攻击的靶点,细胞信号传导途径或功能的改变,可以成为一些药物的靶点等。
     恶性血液病中最成功的靶向治疗是用全反式维甲酸(ATRA)和/或砷剂治疗t(15;17)和/或 PML- RARα阳性的急性早幼粒细胞白血病(APL),用酪氨酸酶抑制剂(TKI)伊马替尼(IMT)及其新一代的TKI药物治疗BCR-ABL+的白血病: 包括BCR-ABL+CML、B-ALL、急性髓性白血病(AML), FIP1L1-PDGFRa。ATRA联合砷剂及蒽环类药物为主的化疗,可使90%以上的APL治愈;TKI可使70%以上的CML长期存活,治愈FIP1L1-PDGFRa阳性的骨髓增殖性肿瘤;TKI对 FIP1L1-PDGFRb、FGFR、 bcr-abl、C-KIT突变的恶性血液病也有效。目前TKI有多种类型,有些类型白血病细胞对某种TKI原发或治疗后耐药,TKI耐药基因突变检测可以帮助选择不同类型的TKI 。目前在临床应用已经产生较好疗效的靶向药物尚有针对JAK2突变的拮抗剂,针对 FLT3-ITD突变的索拉菲尼,针对CD19、CD20、CD22、CD25、CD33、CD52、VEGF/R的单抗。这些靶向药物在临床可起到四两拨千斤的作用。比如一些用各种化疗药物无效的恶性血液病,用靶向药物很快获得缓解,单独或联合其它治疗治愈患者。
    其它一些类型的疾病选择性对某种治疗更有效,如单纯的NPM突变、AML1-ETO+、CBFB-MYH11+AML可从大剂量阿糖胞苷(HD-AraC)治疗获益,雷利度胺治疗5q-约40%以上的患者获得完全细胞遗传学缓解;蛋白酶抑制剂及血管生成抑制剂治疗多发性骨髓瘤疗效好等。
   除了以上几类药物外,目前还有很多靶向治疗药物进入治疗白血病血液病的临床试验或正式被批准,包括以下几类。(1) 针对FMS 样酪氨酸激酶3(FLT3)的靶向药物。(2) 针对KIT 受体激酶的靶向药物。(3) 法尼基转移酶抑制剂 。(4) 去甲基化药物。(5) 组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂。 (6) 血管生成抑制剂。 (7) 趋化因子抑制剂。 (8) 细胞凋亡诱导制剂。(9) 细胞周期依赖激酶(CDK)抑制剂。(10) 蛋白激酶C(PKC)抑制剂。(11) 热休克蛋白90(HSP90)抑制剂。(12) SRC激酶抑制剂。
   由于恶性血液病细胞上有一些正常细胞不表达的蛋白,可以引起免疫系统识别并攻击,称为肿瘤免疫排斥抗原。目前很多白血病血液病疫苗已经进入临床试验,多为多肽或蛋白疫苗, 如BCR-ABL、PR1、PR3、WT1、RHAMM (CD168),也有一些肿瘤细胞疫苗或树突状细胞(DC);疫苗可以诱导免疫反应,主要用于清除化疗后、HSCT后、IMT、干扰素(IFN)治疗后的MRD或预防复发。
    治疗中,恶性血液细胞上的靶点分子可能改变,使靶向治疗或免疫治疗失效,大多数白血病细胞的抗原(包括干细胞标志、人类主要相容性复合体抗原、共刺激分子)会发生改变,这些变化是白血病细胞逃避免疫系统或靶向药物攻击的机制之一。因此在治疗中要定期监测这些靶分子,避免药物浪费或耽误病情。我们在临床中曾遇到一个75岁B-CLL患者,为预后不良的B-CLL,血液白细胞>60´109/L,血液白血病细胞>60%、表达CD20。我们采用CD20单抗治疗后,血液白细胞降至8´109/L,白血病细胞降至4%,丢失CD20抗原,我们就没按原计划定期用CD20单抗;以后定期观察,待血液白细胞增加20´109/L,白血病细胞上出现CD20抗原后,再采用CD20单抗;此后患者一般在1-1.5年用一次CD20单抗,病情控制很好,也无明显副作用,至今生存已经>3年,已经超过预期的生存期。
    恶性血液病在异基因移植后会有这样的现象:在移植物抗宿主反应(GVHD)很重的同时恶性血液病复发,这与恶性血液病细胞丢失MHC分子逃避T细胞的移植物抗肿瘤作用(GVT)有关,这时的治疗就不能采用供者淋巴细胞输注(DLI)治疗,而应该采用天然免疫效应细胞治疗,如自然杀伤细胞(NK)、NKT、 γδT细胞等,因为这些细胞识别靶细胞不需要识别MHC分子。
4 微小残留肿瘤(MRD)监测指导的个性化治疗
    治疗后白血病血液病缓解(用形态学方法检测不出,血细胞计数正常,其它部位也无肿瘤浸润),但用更敏感的技术仍可检测到白血病血液病细胞,称为微小残留肿瘤(MRD) 。检测MRD的方法主要包括流式细胞分析技术(FCM)或基因定量或荧光标记的原位杂交技术(FISH)。由于影响疾病预后的因素很多,很难完全检查明确,而治疗后白血病细胞下降的幅度和速度可以直接反应白血病细胞对治疗的敏感性,具有很大的预后价值。很多临床试验均证明治疗后的MRD与预后明显相关。国际柏林-法兰克福-明斯特郎(I-BFM)协作组的研究显示,儿童急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)患者化疗后第33、78天MRD阴性的患者(占43%的患者),其10年无EFS达93%;15%患者的MRD³0.1%,其 10年EFS仅16%;43%患者的MRD介于以上两组之间,10年EFS为74%。根据MRD监测结果来调整治疗方案可提高总体生存率。在St Jude XV对标危初治儿童ALL的治疗计划中,对诱导化疗第19天时MRD³1%,第46天MRD³0.01%的患者,在化疗获得完全缓解(CR)后采用强化方案化疗;对任何ALL患者在第46天MRD³1%,或在维持治疗中³0.1%, 采用allo-HSCT治疗。
   国际干扰素与格列卫(IMT)治疗慢性髓性白血病(CML)的随机分组研究显示,如果CML患者接受IMT治疗12个月时BCR/ABL基因水平能够降低3个对数(log)以上,其5年无疾病进展率为100%。其它几项研究也显示,IMT治疗1年内获得主要分子生物学缓解(MMR),是CML-CP期患者无疾病进展的标志。另一项研究显示,IMT治疗后用实时定量PCR方法检测不出BCR-ABL基因者,无一例发生疾病进展;而那些能够查出BCR-ABL者,30%发生疾病进展。但检测不出白血病基因不等于完全清除白血病细胞,有一份研究显示 IMT治疗后BCR- ABL 达0% 持续2年后停药者,6/12例在6个月内复发。
    我们的临床观察也显示,MRD监测对ALL、AML、CML都具有很好的预后价值,阳性结果比阴性结果的预后价值更高。即使是预后好的或预后中等的AL,在化疗或造血干细胞移植(HSCT)后,如果MRD不能较快地降至安全水平以下或在转阴后再次升高,几乎都发生血液学复发,因此应及时采取措施治疗。不同类型的白血病,不同方法检测的MRD,其安全水平不一样。如用流式细胞技术检查出急性淋巴细胞白血病,即使只有0.01%,均复发;而对AML,>95%复发。 PML-RARα阳性的APL,如反复检测出PML-RARα,即使仅有 10-4~-6,几乎都复发,需要积极处理;而AML1-ETO基因,如持续<10-4,复发率较低,不需要太强烈的治疗。
5 异基因造血干细胞移植后供受者嵌合率监测指导治疗
     异基因造血干细胞移植后受者成分增加可能会导致供者成分逐渐被排斥,植入失败,植入失败后如果自己造血免疫细胞能够恢复、恶性血液病不复发,尚属好的结果。很多情况下,植入失败后,恶性血液病复发。因此移植后应定期监测供受者嵌合率,如果供者成分下降,应适当输注供者细胞以重建100%供者造血成分。但是有些情况下,难以获得供者成分,我们可以通过体外细胞培养,扩增供者的免疫细胞来增加体内供者的比例,防治复发。曾经有个患者,白血病复发,骨髓供者成分降至54%,血液供者成分96%,不能很快获得供者细胞;我们用血液细胞分离机采集了供者淋巴细胞培养,再给予患者小化疗,停化疗后数天,血白细胞低期间输注培养的血液淋巴细胞,半个月后骨穿显示白血病完全缓解,骨髓供者成分增加至96%。2个月后再用以上方法治疗1疗程,骨髓供者成分增加至99%。半年后获得供者淋巴细胞输注,患者长期存活至今3年以上。
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